mRNA瞬时表达工程化CAR-NK治疗结直肠癌

1概括

通过将NK细胞受体NKG2D的胞外结构域与DAP12融合，构建了一个嵌合抗原受体（CAR）来改善NK细胞的肿瘤反应，采用一种提供CAR瞬时表达的mRNA电穿孔方法作为风险缓解策略。NKG2D RNA CAR的表达显著增强了NK细胞对几种实体肿瘤细胞系的溶细胞活性，并为已确定的实体肿瘤小鼠提供了明确的治疗益处。3例转移性结直肠癌患者随后接受了局部输注CAR-NK细胞的治疗。在前2例腹腔注射低剂量CAR-NK细胞的患者中，腹水生成减少，肿瘤细胞数量显著减少。第三例肝转移肿瘤部位转移的患者在超声引导下经皮注射治疗，然后腹腔输注CAR-NK细胞。通过多普勒超声成像观察到肝脏区域的肿瘤快速消退，并通过PET-CT扫描证实了治疗后的肝脏病变有完全的代谢反应。

2介绍

自然杀伤细胞（NK）是一种先天的淋巴细胞，它可以识别和溶解转化的细胞和被病毒感染的细胞，而不需要事先激活。NK细胞能够以抗原不依赖和非主要组织相容性复合体（MHC）限制的方式诱导针对恶性肿瘤的免疫应答。重要的是，NK细胞异源供体移植产生了有益的移植物抗白血病结果，并保护患者免受移植物排斥和有害的移植物抗宿主病（GVHD）。异体NK细胞治疗的良好治疗和安全性被认为是自体T细胞过继治疗的一个重要的实际优势。

NK细胞对癌症的细胞毒性潜力是由一组内源性激活和抑制受体调节的。在激活受体中有自然杀伤组2成员D（NKG2D）受体。NKG2D受体由人类NK细胞、CD8+ T细胞、gd T细胞和NKT细胞表达，可以与8个NKG2D配体（NKG2DLs）相互作用，它们属于两个家族：两个MHCI类链相关蛋白MICA和MICB，以及6个人巨细胞病毒（HCMV）ul16结合蛋白（ULBP1-6）。NKG2DLs通常在健康组织中不表达，但在DNA损伤、感染和细胞转化时可上调，因此通常在癌中被检测到。由于其肿瘤相关的过表达，NKG2dl已成为抗癌策略的良好治疗靶点。

CARs可以将免疫细胞的特异性重定向到癌细胞表面抗原，包括NKG2DLs。假设，将NKG2DLs特异性的CAR引入NK细胞后，CAR与癌细胞上表达的配体结合，可以直接激活NK细胞，从而显著增强细胞的抗肿瘤免疫力。为了验证这一假设，构建了一个利用人类NKG2D受体的胞外结构域（ED）与DAP12的胞质结构域融合的CAR，DAP12是一种与激活NK细胞受体相关的适配器分子，在激活的NK细胞的信号转导中至关重要。为了解决NKG2D CAR对非肿瘤组织的靶上和肿瘤外毒性的关注，采用了RNA CAR方法来瞬时增强NK细胞对NKG2DLs的特异性及其肿瘤细胞杀伤活性。进一步假设，用CAR-NK细胞局部治疗腹腔内肿瘤将是一种安全有效的方法。本研究旨在验证这些假设。

3结果

表达NKG2D CAR和DAP12的NK细胞在体外可产生强烈的细胞毒性免疫反应

设计了两种NKG2D RNA CARs，分别包括NKG2D的ED、CD8a铰链和跨膜区，以及细胞内信号域CD3zeta（NKG2Dz）或DAP12（NKG2Dp）（图1A）。并采用CMV正向引物和150 Ts反向引物对CARs模板进行PCR扩增，PCR扩增子用于RNA转录，生成用于NK细胞电穿孔的mRNA CARs。

NK细胞的电穿孔EGFP融合CD3 zeta（mGFP），控制构造EGFP取代ED NKG2D，没有增加NKG2D表达，增加NKG2D表达后观察到电穿孔NK细胞NKG2Dz或NKG2Dp（图1B）。电穿孔后24h NKG2Dp CAR表达的延时分析表明，RNA CAR表达维持了至少5天。

为了比较NKG2Dz和NKG2Dp mRNA CARs电穿孔NK细胞诱导的细胞毒性免疫反应，从相同供体和相同控制条件下用相同数量的mRNA CARs扩增的NK细胞电穿孔。首先用人SKOV3、HCT116和Detroit562癌细胞作为目标，进行了IFNγ ELISPOT试验（图1C）。

使用斑点计数机进行的分析表明，与对照组NK细胞相比，配备CAR的NK细胞的斑点发育更强（p < 0.001）。比较两种不同的NKG2D RNA CAR修饰的NK细胞，NKG2Dz CAR修饰的NK细胞的IFNγ分泌水平相对低于NKG2Dp诱导的NK细胞。使用Delfia细胞毒性试剂盒进行的体外细胞毒性试验进一步证实，与NKG2Dz CAR修饰的NK细胞相比，NKG2Dp CAR修饰的NK细胞更能有效地杀伤癌细胞（图1D）。基于这些结果，选择了NKG2Dpcar修饰的NK细胞进行下游研究。

图1 NKG2D配体特异性CARs

多次注射CAR-NK细胞可延缓荷瘤小鼠的疾病进展

为了证明NKG2D RNA CAR修饰的NK细胞体内肿瘤杀伤作用的概念，建立了异种移植小鼠模型。将1107人结直肠HCT116-Luc癌细胞注射给NSG小鼠。肿瘤细胞注射后7天，给予荷瘤小鼠静脉注射。注射PBS、模拟NK细胞或用NKG2Dp CAR修饰的NK细胞（每次注射1个107细胞），每周2次，共3周。从第7天到第42天，用HCT116-Luc细胞的无创全身生物发光成像（BLI）监测肿瘤的生长情况（图2A）。BLI显示，在PBS和模拟NK细胞治疗的两组中，HCT116肿瘤进展积极。在用NKG2Dpcar修饰的NK细胞治疗的小鼠组中，在3周的治疗期间，肿瘤负荷相对于最初的肿瘤负荷降低，但在治疗结束后发现肿瘤再生。由于疾病进展迅速，两个对照组的小鼠分别在第37天和第47天实施安乐死（图2B）。相比之下，接受NKG2Dpcar修饰NK细胞的小鼠对肿瘤快速进展有显著保护作用，与PBS组相比，小鼠的中位生存时间延长了92%，与模拟NK组相比延长了53%（p<0.0001；图2B）。

图2 用NKG2D CAR mRNA电穿孔的NK细胞对小鼠肿瘤模型NSG小鼠的影响

将CAR-NK细胞过继转移到患者的腹膜腔对控制恶性腹水具有临床益处

2例患者，1001和1002，有大量疾病负担和恶性腹水，接受了多轮腹腔NK细胞剂量递增输注。患者1001接受了2次自体NK细胞制备的CAR-NK细胞（2×10⁷和1×10⁸），患者1002接受了4次异基因单倍体NK细胞制备的CAR-NK细胞（1×10⁸,3×10⁸,5×10⁸，和7×10⁸）。直接局部注射到腹膜腔可以使CAR-NK细胞快速进入肿瘤部位，促进转移细胞和癌细胞之间的相互作用，并限制与全身暴露于CARNK细胞相关的潜在靶上和肿瘤外风险。

观察到，在两名患者的腹水中，上皮细胞粘附分子（EpCAM）阳性癌细胞的数量显著减少（图3A）。CAR-NK细胞在第一次注射2×10⁷细胞后，对癌细胞的细胞毒性变得明显。腹水液中的癌细胞数量在治疗过程中持续减少，并在治疗结束时几乎无法检测到。两名患者的腹水体积也显著减少（图3B）。患者1002通过计算机断层扫描（CT）成像评估了腹水体积的变化，这证实了腹水的减少（图3C）。虽然1002患者腹水最初是乳白色的，但静脉注射后变得明显。CAR-NK细胞的治疗（图3D），明确表明了控制恶性腹水的临床益处。

图3 腹腔注射CAR-NK细胞对恶性腹水的影响

超声引导下经皮注射CAR-NK细胞可有效减轻肝转移性结肠癌患者的肿瘤负担

病人1003提出了不可切除的转移性结直肠癌，进展后三行传统的系统治疗，治疗后注入同种异体CAR-NK细胞：5×10⁸ CAR-NK细胞管理2/周第一周，1×10⁹ CAR-NK细胞2/周在第二周，和2×10⁹ CAR-NK细胞2/周在第三周。从第二次输注开始，由超声引导，每一剂量的CAR-NK细胞的一半经皮注射到肝段VI中具有高代谢活性的癌症病变中，其余的CAR-NK细胞被静脉注射。灌输在肝脏区域观察到可测量的临床反应。多普勒超声检测到注射2.5×10⁸ CAR-NK细胞后4天，CAR-NK细胞肝脏区域肿瘤面积从66.0 mm28.5mm~46.9mm24.0mm（图4A）。在基线和开始CAR-NK治疗后4周，分别进行CT和PET扫描。通过氟脱氧葡萄糖（FDG）PET/CT成像，治疗结束后，肝段VI的最大标准化摄取值（SUVmax）从8.2下降到0.14（图4B和4C）。组织学检查与H&E染色标本收集针活检（图S13）显示，坏死组织与一些肠道腺癌细胞的标本收集CAR-NK注射网站，而完整的腺癌组织清晰可见的标本收集的非注射肿瘤网站（图4D）。总的来说，这些发现提示了图像引导下经皮注射CARNK细胞的治疗作用，这是一种微创和可重复的程序，在患者中诱导强大的局部抗肿瘤作用。

图4 超声引导下局部注射CAR-NK细胞对转移性结肠癌的影响

4总结

这项研究测试了用一种新型的NKG2D CAR修饰的NK细胞，这是一种由NKG2D ED和DAP12组成的CAR。与CD3z包含三个免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAMs）的CD3z不同，DAP12包含一个能够结合Syk和ZAP70激酶的单一ITAM，提供了参与NK细胞抗肿瘤活性的另一种信号通路在目前的研究中，所有三名患者都成功地生产出了符合释放标准的临床级CAR-NK细胞产品。该技术植入成功率是最重要的可行性终点。然而，由于短暂的CAR表达特征，无法评估过继转移的CAR NK细胞在体内的命运。所有3例患者均达到了安全终点，因为CAR-NK细胞耐受性良好，没有严重的不良事件，包括高级别细胞因子释放综合征。测试了CAR NK细胞的多剂量水平，但没有发生剂量限制毒性。

本研究表明过继转移的NKG2Dp CAR-NK细胞在转移性结直肠癌患者中确实识别肿瘤细胞并显示抗肿瘤效应功能。在两个恶性腹水患者治疗腹腔注射CAR-NK细胞，腹水肿瘤细胞的数量明显减少即使注入一个低剂量的细胞和几乎无法检测到的水平结束的治疗（图3）。在第三例接受超声引导下经皮注射CAR-NK细胞的患者中，在注射部位检测到完全代谢反应（图4B和4C），证明了CAR-NK细胞对转移性结直肠癌的直接作用。从注射部位收集的活检样本中NKG2DL表达缺失，在同一活检样本中（图4D）发现坏死，这进一步支持了靶向性的论点。结合发现在小鼠肿瘤模型如图2所示，NKG2DL阳性肿瘤的生长有效抑制NKG2Dp CAR-NK细胞而不是NK细胞表达非CAR或NK细胞，得出结论，观察完整的代谢反应可能是，至少在一定程度上，特定的癌细胞裂解效应由NKG2Dp CAR-NK细胞。

参考文献：

https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2019.03.011

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